各类细胞培养

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巨噬细胞培养
1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
) p8 |9 S, |* ^0 d" |6 }) S7 Q% b3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
9 h3 \' b; V$ o- D4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。
7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。
8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
* F# \! L  j3 L0 t9 c9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。



& Q2 z. O' {5 C8 \肌组织细胞培养

3 w; {% J) y  V0 ~骨骼肌细胞培养
1．杀死动物，无菌取大腿肌组织，切成0.3～0.5厘米小块。
2．用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25％胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过，合成培养基加10％小牛血清培养，为促进分化可加1％的胎汁。
3．细胞接种量为2×106/皿，接种在胶原或明胶的底物上能促进细胞分化。明胶制备比较简单，常用Hanks液配的0.01％明胶。  
1 q$ }" |& r' d8 ?" @$ z肌细胞培养
1．选新鲜受精鸡卵，置温箱中孵育（温箱中放有水槽，以维持箱内温度），每日翻动一次（180度），孵育9～12天。
2．取鸡胎法相间《组织培养和分子细胞学技术》53页。
0 L4 X7 d) R' Y3．用眼科剪剪开胸腔，剥出心脏，置入皿中用Hanks液漂洗1～2次。
4．小心剪除大的动静脉，保留心室肌，用组织块或消化培养法均可。
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神经组织细胞培养
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+ L- E! |! E% ~) j" P- u0 J1．获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入Hanks液中漂洗1～2次后，置于30～50倍的Hanks液中，脑组织比较柔软，反复吹打即可制成细胞悬液。
# Y. F& P. R1 c/ i1 ~7 t' B+ P2 L2．为排除脂肪成分和其它碎块，把悬液注入离心管中，在室温直立5～10分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获得较多的细胞成分。
3．向末次沉淀物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置5％CO2温箱中培养。
4．细胞生长汇合后，可用0.25％胰蛋白酶消化法做传代处理，加消化液的量以能覆盖细胞层即可，待细胞开始从瓶壁脱离（平均5～10分钟），加入含有血清培养液，吹打制成细胞悬液。
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6 u: N8 J! j# P0 \神经胶质细胞培养
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神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。
. l! v* f3 G, @8 m  人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。
养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。
0 D8 G! S+ M7 Z6 n, m, U' K0 A, N2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。
0 R5 y1 \' Q8 v" I4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。
/ ~+ O% ~4 m  k0 @, t. y5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。
( I' Y2 }! M$ E% K, o该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。

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内皮细胞培养
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5 E5 z. ~% Z& {& ]3 L内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。
7 t+ P9 S8 \' i8 m0 k  研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：
( U& Q  W% u+ l1 c9 g/ Z5 G1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。
! Z" L# k7 }2 E6 ~: A2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。
  s& b4 M7 }* G+ S" R6 F9 {3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。
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上皮细胞培养
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+ W" J% f9 z, B0 Z9 V3 O" t上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。
6 ]2 u2 I+ Q8 P1 a4 \    体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。
    以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫  1981）
( d: ]4 o5 W$ ~" s7 [1 Y  J5 z    1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。
, L* _/ P8 X) f6 u    2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。
    3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。
    4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
; L/ s- `8 L. P$ A1 [5 I    5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。
    6、反复吹打，制成悬液。
. x1 y* u6 @  H1 L% e    7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
    8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。

yuanfengtcm

谢谢哦。
和我做的有些出入。
在努力啦。

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zhaokan

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浪漫小床

多谢了，有可能我实验就要用到啊