PCR实验步骤

yuanfengtcm

一、试剂准备
1. DNA模版
7 ?& o/ U2 a5 K. _  j  P. a2．对应目的基因的特异引物
1 c+ W/ P- u7 B4 r- d3．10×PCR Buffer
; ~5 \% t0 K, i( x# i: p4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
2 `3 W' B, _( n6 K9 ~7 r5．Taq酶
+ _. F; ~0 O% X7 t  g( W4 u, F二、操作步骤
  X2 A  [' K$ r1 j, ^ 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。        
10×PCR buffer                       5 μl      
0 _' \: p1 f, S% k dNTP mix （2mM）              4 μl    　  
引物1（10pM）                    2 μl      　
. |; q# R* S# B/ h) r1 c7 k1 I4 x引物2（10pM）                    2 μl        
4 s7 E0 r# x, ?. K* B( QTaq酶（2U/μl）                   1 μl        
6 N' h0 x; ?4 S: YDNA模板（50ng-1μg/μl）　  1 μl        
  K) `2 P6 _' u" p; g. X5 O加ddH2O至                           50 μl    视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
' Q  h, p8 g+ {9 Q7 C2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
4 I! d$ m# ?4 t7 a1 M3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
. ?/ j* A0 n. H$ e3 ]! o4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化  　
       PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。
1．反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。
8 L( [7 U1 d. z6 v2． dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
3． Taq DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。
7 @$ A* w* {0 c; v/ {4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
7 w1 M0 G) h& i, k0 H3 T3 K⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。
" d( Y3 W; d" @8 s( f+ y0 l9 d4 _⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。
⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。
' l" A9 k2 ?) h+ e⑸  引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
6 x; e1 k8 q- u; B7 d  v* e  U5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
& X. V( ~: y+ v' i# e) T5 A6． PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。
四、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
$ p. `+ i% X1 w, J( x# h5 V" W7 u4 \7 g７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。