琼脂糖凝胶电泳

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琼脂糖凝胶电泳
. `! r1 ~, x- H! `9 P% W在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3） 电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5） 区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。 琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。 　　琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过 高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结 晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。1.      用封边带封住塑料托盘开放的两边或清洁干燥的玻璃板的边缘形成一个模具，置一个水平支架上。
+ u! `, u3 z/ d4 L/ V2.      配制足量的电泳缓冲液（1×TAE或0.5×TBE）用以灌满电泳槽和配制凝胶。 配胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液。
3.      根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于烧瓶或玻璃瓶容积的50%。
4.      用Kimwipes松松地塞住三角烧瓶颈部，如用玻璃瓶一定松松盖住。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。
1 m+ n4 m6 R; A+ O5.      用隔离手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到55℃水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭，终浓度为0.5μg/ml。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。
6.      琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置在托盘底面上0.5～1.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。
2 w# f6 F" q+ K+ C  K; B7.      浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为3～5mm。
8.      让凝胶溶液完全凝结，室温下30～45min。加少量电泳缓冲液于凝胶顶部，小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液。轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。
9.      向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。
3 N* C) @- S% c10.  混合DNA样品和0.2倍体积6×载样缓冲液。
% C" e# _6 h, ?3 s8 I3 q11.  用微量移液器及一次性吸头，或拉长的巴斯德吸管，或玻璃毛细管将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。
12.  关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极（红色插头）侧泳动。给予1~5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离后再停止电泳。
; u6 l8 Z3 {' D6 C' K' `1 F13.  当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖。若凝胶和缓冲液有溴化乙锭（0.5μg/ml）的水或电泳缓冲液中室温浸染30～45min，或者用电泳缓冲液1：10 000稀释的SYBR Gold贮备液浸染。
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