流动相的选择

mjb96

流动相的调节是搞液相分析最重要的环节，也是液相水平高低的度量，每一种液相都有影响它的主要因素，抓住主要因素，问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！
先开个头：常用的是化学键合相色谱，分离中性化合较简单，主要是调节溶剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出峰就早。分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手。问题就容易解决。     


液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质，针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷　、氨基柱、氰基、苯基太多了，再加上不同流动相也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分，比如：酸性的可以用十八烷加入酸，加缓冲盐；碱性物质可以加缓冲盐，以个人来讲用离子对的形式较多，并且效果也很好，现在分析生物碱是比较难做的，我现在就有一个难题，就说盐酸水苏碱吧，在低波长的吸收，UV是不行了，用蒸发光检测器，但是分离又成了问题，我试了十八烷，氨基柱、氰基、都不理想，并且用过日本的shodex（C18）柱PH9-10不好。不好做呀，在郁闷中…………………     


  b+ r$ i3 n& L. a, P, z; A如用反相色谱柱时，一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变pH值，酸性物质将pH值调低，碱性物质将pH值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠用于（碱性药物）     
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3 K. f% z7 U! J0 `. Z, Z9 g# k我觉得溶剂过滤器抽滤时抽走一部分有机相使保留时间相差较大。     

其实流动相的调节也是很难的，一个条件下来是非常的不易呀，从查文献到，条件成熟，有一次我做麻黄就是二个月呀，最后才定下来，现在的水苏碱又是一个大头，现在为什么生物碱这样的难做呢，柱前衍生我是考虑过，但对柱子是有影响的，同时处理也麻烦。
1 I, S% U! q! B& Z9 v对于流动相的抽滤对测定是没什么影响的，一个稳定的条件，是不计较那一点损失的，如果抽滤对于测定的影响非常之大这个条件是不稳的。
5 z" U9 P# Z  m8 ]现在的流动相在检验所比例是可调的，但酸碱不变，所以我个人认为在一定的比例范围内，耐用性一定要好。有高手的话对我的水苏碱给一点意见     
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一. 反相HPLC中的溶剂优化：1.首先应调整k’值：强溶剂→20％递减→选择合适的溶液强度，使得k’在1～20（tR：3～35min）。 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度)。（反相色谱——溶剂极性弱洗脱能力强，组分k’减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。2.改变选择性(á)：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同，根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。
二. 离子对HPLC中的溶剂优化: 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。
① 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。
反相离子对色谱中流动相的影响小结 ：1.改变选择性：a.改变溶剂种类: 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b.改变pH: 组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此要求。c.系统选择:使用一种有机溶剂(甲醇)；流动相的其它三种成分为pH=2.5(和pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM)的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(B—D)进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k’值范围大致恒定。
三.正相HPLC中的溶剂优化
①溶剂
非极性溶剂：正己烷或FC-113（1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷）
极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位
按正相HPLC中谱峰间距效应分类的溶剂
取代和定位是正相HPLC流动相选择性的主要来源
" S& Z# L  N! u. Y& x% H7 m②溶剂强度调节
$ ^2 n! K2 Q% B! J! w6 o③选择性影响
四、梯度洗脱
% ]4 \. J9 Q- n3 M! q6 G; q3 p梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。
% E; b  o: R! o# n, B* r! e, U梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC中的甲醇)的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作 B％ 。
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梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k’范围宽，不能用等度方法简单地处置。
１．梯度洗脱期间的平均k’值
% O' O- ]. F1 g! {8 LtR=tm(1+k’)
VR=Vm(1+k’)=Vm+kVs     

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# `/ F6 T% [% q( A0 ]/ P我做液相时，为什么主峰总是出现肩峰？是柱效降低了还是制剂中的成分没有完全被分离出来？应该如何处理肩峰？     
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　　出现上述情况的原因，可能大致考虑以下几个方面：一、就是组分影响，也就是有与主峰保留时间相近的组分峰（杂质峰）的存在；二、柱子柱效明显降低，是柱子要坏掉的先兆；三、主药在流动相中发生部分离解，使一部分主药的结构状态发生改变。等。
2 P% X5 W; z* F　　解决方法，对应解之，即可。
. K) ?2 ^: _1 W: U　　（个人见解）     

6 w9 t' \+ ]; l各们讲的都很厉害啊，我是初学者不太了解。
但在操作中常要根据要分离的物质加适当的离子对试剂，
而离子对试剂是如何选择的呢？     
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我在做盐酸水苏碱时也遇到了楼上的问题，尝试了UV及ELSD，都不是很理想，最近看到有人用柱前衍生然后用UV，但自己没做过，不知效果怎样。但出于检测方法应该越简单越好真想快点找个即简便又有效的方法。
  我也在做盐酸水苏碱，用的是SCX（离子交换柱）柱，出峰时间在8——9分钟之间，样品经处理后基线分离的比较好，唯一不好的就是峰型有些拖尾。因为它的流动项是缓冲溶液，所以调了一下配比，发现离子交换柱出峰并不象ODS柱那么有规律，随着pH的加大，峰对称性升高，峰宽减小，离子交换柱出峰有一明显波谷反而宽度增加，峰形变大。盐酸水苏碱标准品峰对称性最多只能达到0.58
+ s- o0 s/ M: _不过还是比ODS柱出峰要好     
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针对做生物碱的朋友：
1. 用常规的ODS柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重！
. h& }  H# \) d原因：ODS柱有很多未键合的硅羟基，与N缔合造成。
解决方案：使用BDS柱，他是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾现象！
2. 用常规的SCX离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动相的pH值大小，Rt变化大！
" N$ s1 N; C) _6 l. c5 m; Q原因：所谓离子交换柱，就是阴阳正负离子的交换，由于流动相的离子浓度的变化，势必会影响交换平衡！
3 h1 x. _% L0 `  }1 J' o解决方案：流动相用Buffer缓冲液！     

+ K. D9 o9 ?! w4 A4 K) h9 c向各位老师请教，我做液相时出现了进空白，样品，原料都没有主峰的现象，过去做过这个，正常，请帮忙分析一下     

/ N5 c2 T  J2 d9 `: e) K补充一下，以前配流动相是乙腈与盐混合过滤，再超声，这次是先滤盐，后滤乙腈，再超声，这一步应没问题吧     

7 C% y! y" Q. y  c: t3 |, v' V我买的新的ODS碳18柱子,做白藜芦醇和它的苷,标样混标,出峰比较好.但是后几个点保留值提前,今天进样,发现有肩峰,但是保留时间基本一致.流动相是甲醇和水,40比60.怎么办呢     

hu_2104411 wrote:
8 o( t& [/ j/ a- I1 e. }我买的新的ODS碳18柱子,做白藜芦醇和它的苷,标样混标,出峰比较好.但是后几个点保留值提前,今天进样,发现有肩峰,但是保留时间基本一致.流动相是甲醇和水,40比60.怎么办呢
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0 y* s2 h# V# C2 Y0 g3 z' r, E, C可能是柱子脏了，用异丙醇或者四氢呋喃冲洗一下，柱子现在的压力比最初使用时高多少？     


请问base-deactivated octadecylsilyl silica gel是什么柱？谢谢！     
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bds是填料经过碱基去活的ods,就是将硅胶表面的硅醇基碱性硅烷化,适合于弱碱性和弱酸性化合物. 对于某些色谱的分离较好。对于离子对色谱，有时不加离子对，分离也很好，峰的对称性也有很大改善，当然，其作用不止这些。可以当作普通的ods用，但价格较贵。     
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我接触液相刚一个月，做硕士课题，用液相分离血中的ATP,ADP,AMP,NAD,NADH,NADPh,NADP
, H" d3 x; G  V8 b  x5 n条件：4.6*250，5um，流动相：磷酸钾缓冲液，0.05mol/l，ph6.0,甲醇10%
流速1.0ml/min
. O, s# h/ _+ A) W跟文献上的一样可是我的ATP,ADP出峰时间早了两分钟，而且两者根本分不开了，所有的原因都想到了可分离度还是很低。
' c. h9 K6 r/ d* h3 k2 Q另外，对标准品分离可以，但样品分不开，怎么解决呢？
6 p/ z9 x2 T0 A" D& L很郁闷，谢谢各位老师